Mejorando la congelación del semen de carnero: añadiendo trehalosa

La congelación de semen es la mejor manera de conservarlo a largo plazo, años e incluso siglos. No obstante, no basta con realizar la congelación y almacenarlo a muy baja temperatura. Al descongelar, los espermatozoides deben estar en buenas condiciones para conseguir llegar al óvulo y fecundarlo. La congelación de tejidos vivos es un proceso complicado, en el que es fácil destruir las células o alterarlas de manera que no son capaces de realizar su función. La criopreservación de semen de toro ha permitido la realización de la inseminación artificial con dosis de semen descongelado desde hace más de 50 años, lo cual ha revolucionado el sector. Actualmente, se puede congelar exitosamente el semen de otros rumiantes, pero los daños sufridos por los espermatozoides y otras complicaciones (por ejemplo, en ovino, la dificultad para inseminar por vía vaginal) han impedido que esta tecnología tenga el mismo impacto que en el ganado bovino.
Una de las estrategias para congelar espermatozoides evitando dañarlos es la utilización de sustancias crioprotectoras (literalmente, "que protegen del frío"). Estas sustancias son generalmente azúcares, alcoholes, o sustancias complejas (como la yema de huevo o la leche descremada), que evitan la formación de hielo o protegen a las células asociándose con sus estructuras (membranas, proteínas) y estabilizándolas.

Glicerol: transparente,
 viscoso y crioprotector.

Acabamos de publicar un interesante estudio en colaboración con unos investigadores de la Universidad de Teherán (Irán), sobre la mejora de la congelación de semen de carnero utilizando distintas combinaciones de crioprotectores. Estos investigadores han estado ensayando la congelación de semen de carnero utilizando medios con lecitina de soja y glicerol (glicerina) como crioprotectores. Lo interesante de este estudio es la utilización de trehalosa, un azúcar, para mejorar la protección de los espermatozoides.
La trehalosa es un disacárido, es decir, un azúcar compuesto por dos azúcares sencillos unidos en una sola molécula, como los azúcares que consumimos normalmente en muchos alimentos (sacarosa en el azúcar de caña o remolacha, lactosa en la leche, maltosa en la cerveza, etc.). La trehalosa es poco común en vertebrados, pero se encuentra en crustáceos, insectos, plantas y hongos. En muchos organismos tiene función energética, dado que está compuesta por dos moléculas de glucosa, pero lo más interesante es que en algunos invertebrados, hongos y plantas la presencia de grandes cantidades de trehalosa les permite resistir la desecación y la congelación.

La trehalosa está formada por dos
moléculas de glucosa unidas
 por un enlace alfa 1-1.

La participación de la trehalosa en estos procesos de resistencia biológica a fenómenos adversos ha conducido a su utilización en medios de criopreservación seminal. Una búsqueda rápida en PubMed nos devuelve más de 90 trabajos publicados en revistas del área biomédica, a la fecha de este artículo. La originalidad del trabajo que nuestros colegas iraníes realizaron fue la combinación de distintas concentraciones de glicerol y de trehalosa. Nuestra hipótesis era que el glicerol y la trehalosa podrían interaccionar, y que en determinadas concentraciones su efecto podría reforzarse (efecto sinérgico). Los diluyentes que se probaron en este estudio fueron:

• Glicerol al 5% (sin trehalosa).
• Glicerol al 5% y trehalosa 50 mmol/L.
• Glicerol al 5% y trehalosa 100 mmol/L.
• Glicerol al 7% (sin trehalosa).
• Glicerol al 7% y trehalosa 50 mmol/L.
• Glicerol al 7% y trehalosa 100 mmol/L.

Para que os hagáis una idea, una concentración de glicerol al 5% o 7% es equivalente al volumen de alcohol en una cerveza típica. En el caso de la trehalosa, la concentración está en una unidad que se utiliza mucho en investigación, moles por litro de solución. Las concentraciones utilizadas se corresponderían con unos 25 y 50 g/L, aproximadamente. Más o menos, un par de sobrecillos de azúcar en un café grande.

Resultados de movilidad espermática tras descongelar
(porcentaje de espermatozoides que seguían siendo móviles).
En la parte inferior se ven las concentraciones de
trehalosa (T) y glicerol (G) de cada diluyente. Las líneas
horizontales muestran el valor de la media (28 muestras de
semen obtenidas de 4 carneros) para cada tratamiento, y las
líneas verticales muestran la confianza en la media (error
estándar e intervalo de confianza al 95%). Se aprecia que el
resultado medio más alto corresponde al diluyente con 5% de
glicerol y 100 mmol/L de trehalosa, seguido por el que llevaba
7% de glicerol y 50 mmol/L de trehalosa. Cuando las medidas
están acompañadas por letras distintas, quiere decir que se
detectó una diferencia significativa entre ambas (es decir, sería
improbable que esa diferencia se debiese al azar).

¿Qué resultados obtuvimos? Pues al añadir trehalosa al medio de congelación, obtuvimos mejor calidad espermática al descongelar, lo cual nos indica que este azúcar podría ayudarnos en nuestro objetivo de mejorar la conservación seminal en ovino. Sin embargo, no pudimos decantarnos tajantemente por una concentración de trehalosa u otra, ya que el mejor resultado dependía de la concentración de glicerol que hubiésemos añadido. De hecho, la combinación de 100 mmol/L de trehalosa con el 7% de glicerol dio peor resultado que el no añadir trehalosa en absoluto. En cambio, añadiendo la mitad de trehalosa (50 mmol/L) al medio con el 7% de glicerol obtuvimos una mejora bastante importante en la calidad seminal.
No obstante, los mejores resultados los obtuvimos al añadir 100 mmol/L de trehalosa al medio con un 5% de glicerol. Esto nos llamó mucho la atención, ya que si no añadíamos trehalosa el medio con un 7% de glicerol era ligeramente superior al de 5%.
Todo esto nos confirmó que, efectivamente, la trehalosa y el glicerol se comportaban de manera distinta cuando estaban ambos presentes, y dependiendo de la cantidad de uno y otro, los resultados obtenidos eran muy distintos. Aquí está la gran originalidad de este trabajo, y que aparentemente no había sido descubierta anteriormente.
¿Hemos realizado un gran avance para permitir el desarrollo de la inseminación artificial en ovino? Sólo uno pequeño, pero que tal vez dé pistas para desarrollar mejores diluyentes de inseminación. Hemos determinado una mejora en la calidad seminal tras descongelar, pero ignoramos si esto se traduce en una mejora de la fertilidad. Ahora toca seguir por este camino y comprobar qué sucede si, por ejemplo, variamos la cantidad de lecitina de soja en el diluyente, utilizamos estas combinaciones en diluyentes con yema de huevo, o si probamos otras concentraciones de glicerol y trehalosa.

Trehalose and glycerol have a dose-dependent synergistic effect on the post-thawing quality of ram semen cryopreserved in a soybean lecithin-based extender.
Najafi A, Zhandi M, Towhidi A, Sharafi M, Akbari Sharif A, Khodaei Motlagh M, Martinez-Pastor F.
Cryobiology. 2013 Mar 13. pii: S0011-2240(13)00109-0. doi: 10.1016/j.cryobiol.2013.03.002. [Epub ahead of print]